Chloroquine 98

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Affiliation: Département de radio-oncologie, Hôpital universitaire de Freiburg, Freiburg, Allemagne Résumé Nous avons demandé si les inhibiteurs de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) / Akt, qui est très active dans les cellules souches du cancer (CSC) et surexprimés en réponse aux traitements génotoxiques , promouvoir - irradiationIR) la mort cellulaire induite dans des cellules hautement radiorésistantes provenant de patients souches comme gliome (SLGCs). De façon surprenante, dans la plupart des cas, les inhibiteurs ne favorisent pas la mort cellulaire induite par IR. En revanche, le LY294002 fortement cytostatique et PI-103 ont même tendance à le réduire. On a induit depuis autophagy nous avons examiné si l'addition de l'inhibiteur de la chloroquine autophagy applicable cliniquement (CQ) entraînerait la mort cellulaire dans SLGCs. La trithérapie avec CQ à des doses aussi faibles que 5 à 10 M en effet provoqué une forte apoptose. À des doses légèrement plus élevées, CQ seul fortement encouragé l'apoptose IR induite dans toutes les lignes SLGC examinés. La forte apoptose en combinaison avec CQ était invariablement associée à une forte accumulation du marqueur autophagosomal LC3-II, ce qui indique une inhibition de la fin autophagy. Ainsi, les effets de l'autophagie promotion de PI3K / inhibiteurs de la voie Akt semble entraver l'induction de la mort cellulaire dans SLGCs - irradiated. Cependant, comme nous le montrons ici pour la première fois, l'inhibiteur fin de l'autophagie CQ favorise fortement la mort induite par IR-cellule dans CSCs hautement radiorésistantes, et triples combinaisons de CQ, IR et PI3K / Akt inhibiteur de la voie de réduction du permis de la dose de CQ requis pour déclencher la mort cellulaire. Citation: Firat E, Weyerbrock A, Gaedicke S, Grosu A-L, Niedermann G (2012) Chloroquine ou Chloroquine-PI3K / Akt Inhibitor Regroupements Fortement Promouvoir - Irradiation induite par la mort cellulaire dans les cellules souches-Like gliome primaires. PLoS ONE 7 (10): e47357. doi: 10.1371 / journal. pone.0047357 Editor: Jeffrey K. Harrison, Université de Floride, États-Unis d'Amérique reçues: 12 Juin 2012, a accepté: 11 Septembre 2012 Publication 16 Octobre, 2012 Copyright: Firat et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités. Financement: Cette recherche a été soutenue par une subvention de la Fondation Clotten au GN. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Intérêts concurrents: Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent. Présentation glioblastome multiforme (GBM) OMS de grade IV est la plus courante et la tumeur du cerveau la plus agressive. Il est toujours fatale, et le traitement standard avec la résection chirurgicale, plus radiochimiothérapie à base de témozolomide-donne une survie médiane de 14,6 mois 1. cellules souches tumorales hautement résistant à la thérapie semblent être au moins en partie responsable de l'efficacité limitée des thérapies actuelles 2. 3 . phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) / Akt (protéine kinase B) la signalisation est aberrante activé dans les glioblastomes et d'autres tumeurs, souvent en raison de la mutation ou de la perte de l'homologue de phosphatase et Tensin (PTEN) antagoniser classe I PI3K signalisation, ou à l'amplification ou la surexpression des récepteurs de facteurs de croissance agissant en amont de la classe I PI3K 4. 5. L'activation constitutive de la signalisation PI3K / Akt est associé non seulement avec la croissance de la tumeur agressive, mais également une résistance à radio - et chimiothérapie. La régulation positive de la voie PI3K / Akt en réponse aux traitements génotoxiques contribue à cette résistance 6. PI3K / Akt stimule une grande variété de molécules en aval, une partie à travers la cible mammalienne de la rapamycine (mTOR). Les deux autophagie, une dégradation et le recyclage voie de lysosome dépendant principalement déclenchée comme une réaction de survie à divers stress sublétaux, et l'apoptose, la forme la plus commune de la mort cellulaire programmée, sont régies par PI3K / Akt / signalisation 7 9. Le PI3K / Akt mTOR voie est également considérée comme une voie importante pour la survie des cellules souches cancéreuses (CCM) 10 stemness. GBM semble conforme au modèle CSC, étant l'une des tumeurs solides mieux caractérisés étudiés sous cet aspect 2. 3. Selon le modèle du SCC, de nombreuses tumeurs peuvent être entraînées par une sous-population de cellules souches ressemblant, CSCS souvent appelées. CSCs dans les cellules de gliome générales et de la tige-comme (SLGCs) en particulier se sont révélés être extrêmement résistant à - irradiation (IR) et chimiothérapeutiques. apoptose bloqués et l'induction de l'autophagie apparaissent cruciales pour cette résistance contribuant à la survie de SLGCs genotoxically traités 3. 11. des résultats contradictoires concernant les effets des combinaisons de IR avec des inhibiteurs de la voie PI3K / Akt ont été obtenus pour les lignées cellulaires de gliome classiques. À la fois l'absence de sensibilisation et de forte sensibilisation à la mort cellulaire IR induite ont été rapportés 12 17. Deux études ont décrit la sensibilisation des cellules tumorales souches ressemblant à infrarouge par le perifosine inhibiteur de Akt dans un mammaire transgénique et dans un modèle de tumeur médulloblastome de souris 18. 19. Cependant, presque ne sait rien sur les effets des inhibiteurs de la voie PI3K / Akt sur la radiosensibilité des cellules souches cancéreuses du patient dérivées humaines. Une seule étude a rapporté une activité accrue des caspases dans une ligne de SLGC - irradiated prétraitée avec l'inhibiteur de PI3K LY294002 ou une dose cytotoxique de l'inhibiteur Akt III (SH6) 20. L'objectif initial de la présente étude était d'examiner si différents types de PI3K pharmacologique / inhibiteurs de la voie Akt favorisent la mort cellulaire IR induite lorsqu'il est administré à un groupe de lignes de SLGC primaires hautement radiorésistantes. Étant donné que les inhibiteurs ne sont pas en général d'améliorer la mort cellulaire a été observée, mais autophagy, nous avons également examiné des combinaisons triples avec la chloroquine (CQ), un inhibiteur de autophagy applicable cliniquement connue pour déclencher l'apoptose dans les cellules tumorales classiques autophagiques. Nous montrons ici pour la première fois que triples combinaisons de IR avec CQ et inhibiteurs de la voie sélectionnés PI3K / Akt sont cytotoxique fortement pour CSCs hautement radiorésistantes à de faibles doses de CQ et que CQ seul, à un peu plus fortes doses, favorise fortement la mort cellulaire IR-induite en CSCs hautement radiorésistantes. la mort cellulaire forte observée dans des combinaisons doubles et triples avec CQ est produite par apoptose déclenchée par l'inhibition de la fin de l'autophagie. Résultats de l'état de Akt et d'inhibition de l'Akt par inhibiteurs de la voie PI3K Akt / Nous avons examiné les lignes de SLGC à court terme de quatre GBM différents (GBM4, 8, 22 et G166). Les lignes expriment stem - et progénitrices marqueurs neuronaux, différencier lors de l'exposition à FBS ou de l'acide rétinoïque, sont tumorigènes sur la xénotransplantation série et sont très résistants à l'IR 21. 22. Tous les quatre lignes ont présenté une expression de Akt activé (pAkt) phosphorylée sur la serine 473 . Deux des trois lignes avec des niveaux élevés de pAkt n'a pas exprimé PTEN, qui régule négativement l'activité Akt (Fig. 1A). Développer Figure 1. PI3K / Akt état d'activation de la voie et l'inhibition de la phosphorylation de Akt par PI3K / inhibiteurs de la voie Akt dans SLGCs primaires. (A) Western analyse par transfert de base Akt, Akt-p, et les niveaux d'expression de PTEN. Sox2 est représenté comme un marqueur de la ß-actine et stemness en tant que témoin de chargement. (B) L'inhibition de la phosphorylation de Akt (sérine 473) et de la protéine ribosomique S6 par inhibiteur de Akt III (Akti), LY294002 et PI-103. Les cellules ont été traitées avec des inhibiteurs pendant 2 heures avant de prélever les échantillons aux fins d'analyse. Nous avons ensuite déterminé pour ces lignes la capacité inhibitrice de trois inhibiteurs de la voie différentes PI3K / Akt: l'inhibiteur large gamme PI3K LY294002, l'inhibiteur de l'éther phosphatidylinositol de Akt lipidique analogique III (SH-6), et PI-103, un composé pyridinylfuranopyrimidine, étant un double inhibiteur de la PI3K de classe I et mTOR 23 (Fig. 1B). des doses submicromolaires de la PI-103 a inhibé la phosphorylation de Akt complètement (à la sérine 473) et de la protéine ribosomique S6, une cible en aval de la majeure / Akt / mTOR PI3K, qui régule la synthèse des protéines et la prolifération cellulaire. LY294002 a également inhibé la phosphorylation de ces deux protéines efficacement. L'inhibition par l'inhibiteur Akt III a été plus faible, en particulier dans les lignes à haute expression de pAkt (Fig. 1B). PI3K / inhibiteurs de la voie Akt ne généralement pas promouvoir IR-induite SLGC mort Même si elle ne phosphorylation Akt partiellement inhibée, inhibiteur Akt III réduit le nombre SLGC fortement à 50 M (Fig. S1A). La réduction numérique forte a été associée à une forte apoptose. Cependant, cette forte apoptose n'a pas été encore favorisée par IR supplémentaire (Fig. S1B). Dans les lignes GBM4 et GBM8, qui ont tous deux p53 non fonctionnel, on observe généralement une apoptose modérée (associée à la catastrophe mitotique) au plus tard 4 jours après l'application de doses modérées ou élevées d'IR 21 (Fig. 2AD). A la concentration de 25 M subtoxique, un inhibiteur Akt III amélioré cette apoptose retardée légèrement GBM8 mais pas dans les autres lignes de SLGC. Développer Figure 2. PI3K / inhibiteurs de la voie Akt ne sont généralement favorisent pas la mort cellulaire induite par IR SLGCs primaires. (A C) Le pourcentage de cellules annexine V / PI positives 2, 4 ou 6 jours après l'irradiation avec 0, 2 ou 10 Gy. Avant l'irradiation, les cultures ont été prétraitées pendant 1 heure avec un inhibiteur de l'Akt III, LY294002 ou PI-103. (D) Exemple de cytométrie de flux mort cellulaire analyses. La population avec une diminution de diffusion vers l'avant la lumière (FSC) dans l'échantillon de 10 Gy irradié reflète le rétrécissement des cellules et de la fragmentation typique de l'apoptose. Au début et au milieu des cellules apoptotiques sont annexine V-positif, mais encore excluent PI cellules apoptotiques tardives avec intégrité de la membrane compromis sont annexine V / PI-positive double. (E) la survie clonogénique 14 jours après le traitement avec un inhibiteur IR / Akt III (25 M) ou PI-103 (0,6 M). Des expériences ont été réalisées en triple exemplaire. Données en courant alternatif représentent un moyen SD de trois expériences indépendantes. La signification statistique est indiquée par un astérisque (p0.05). 50 M LY294002 ou 0,6 M PI-103 prolifération cellulaire fortement inhibée (Fig. S1A), mais n'a pas induit généralement l'apoptose (basées sur l'exposition V annexine et vers l'avant / côté des caractéristiques de dispersion), pas plus qu'ils ne favorisent généralement la mort cellulaire radioinduced (évaluée par propidium PI d'absorption d'iodure). Étonnamment, LY294002 et dans une large mesure PI-103, même réduit le nombre de cellules apoptotiques et mortes dans - irradiated GBM4 et GBM8 SLGCs (Fig. 2BD). Par conséquent, les effets sensibilisateurs observés dans les essais clonogéniques, évaluant la formation de colonies de cellules individuelles, probablement reflètent principalement la prolifération réduite (Fig. 2E). Lorsqu'il est utilisé comme agents uniques, la prolifération réduite induite par les trois inhibiteurs a été associée à G0 / G1 arrêt (Fig. 3A). Comme prévu, IR causé G1 arrestation en ligne GBM22 (la seule ligne avec fonctionnelle p53 21) et G2M arrestation dans les lignes avec p53 non fonctionnel (par exemple GBM4). IR induite G2M arrêt en lignes avec p53 non fonctionnel a été réduit en présence d'inhibiteurs, en particulier PI-103. Cela contribue probablement à réduire l'apoptose IR induite, puisque nous avons déjà trouvé une corrélation entre les G2M arrestation, catastrophe mitotique et l'apoptose retardée SLGCs déficientes en p53 - irradiated 21. Développer Figure 3. PI3K / inhibiteurs de la voie Akt réduisent G2M arrestation et induisent l'autophagie dans SLGCs - irradiated. (A) Les cellules ont été traitées avec un inhibiteur de l'Akt III (25 M), le LY294002 (50 M) ou PI-103 (0,6 M) pendant 1 h, puis irradiées avec 10 Gy. L'analyse du cycle cellulaire ont été effectués 24 heures plus tard. (B) La conversion du cytosol LC3-I autophagosome associée (C), la cinétique de H2AX phosphorylation, une mesure de l'ADN endommager les SLGCs ont été prétraitées avec des inhibiteurs de la voie PI3K / Akt pendant 1 h avant l'irradiation par 10 Gy LC3-II, et . Western blots représentatifs sont présentés. Etant donné que autophagy est habituellement régulée à la hausse comme un mécanisme de survie en réponse aux inhibiteurs de la voie / Akt PI3K et dans de nombreux types cellulaires aussi en réponse à IR 9. 24 27. Nous avons également examiné si autophagy est induite dans SLGCs traités par IR et / ou les trois différents / inhibiteurs de la voie Akt PI3K. Comme on le voit sur la Fig. 3B. quelques heures après le traitement, la conversion de la chaîne légère de la protéine associée aux microtubules 3 (LC3) - I dans le lipidée LC3-II, qui est incorporé dans des vésicules pendant la formation autophagiques autophagosome 28. pourrait en effet être détectée par Western blot. Autophagie induction pourrait être confirmée par la réalisation d'essais de flux autophagiques avec l'inhibiteur fin autophagie stade bafilomycine A1, qui bloque l'acidification lysosomales en inhibant la pompe à protons vacuolaire, V-ATPase 29 (Fig. S2). LY294002 et, dans l'une des deux lignes testées, PI-103 a considérablement amélioré la phosphorylation de la serine 139 radioinduced de l'histone H2AX (Fig. 3C), un marqueur d'ADN cassures double brin. Ceci est cohérent avec l'inhibition hors cible de l'ADN protéine kinase dépendante (DNA-PK) par les deux inhibiteurs 23. Le H2AX-augmentation de GBM22 beaucoup plus forte PI-103 médiée par rapport à GBM4 reflète probablement le rôle majeur de l'ADN-PK dans non homologue fin de rejoindre, le mécanisme de réparation d'ADN dominant dans G1 30. où la plupart de l'arrestation GBM22 SLGCs sur IR (voir Fig. 3A). Par conséquent, l'inhibiteur de l'ADN-PK (NU7441) a augmenté H2AX résiduel plus fortement que dans GBM22 GBM4 SLGCs (Fig. S3). Cependant, l'augmentation de cassures double brin dans PI-103 traités GBM22 SLGCs semblait principalement associée à un bloc de forte prolifération plutôt que la mort cellulaire au cours de notre période d'observation allant jusqu'à 2 semaines (voir ci-dessous). Dans les lignées de cellules tumorales établies, traditionnellement cultivées avec du FBS, utilisés comme témoins, un inhibiteur Akt III améliorée IR induite par la mort cellulaire / apoptose relativement forte dans trois des quatre lignes examinées. LY294002 avait soit un effet positif, négatif ou non, tandis que PI-103 ici aussi tendance à supprimer la mort cellulaire induite par IR (Fig. S4). Promotion de l'IR-mort cellulaire induite par CQ-PI3K / Akt combinaisons d'inhibiteurs de la voie ou CQ seul Étant donné qu'aucun des trois PI3K / inhibiteurs de la voie Akt facilement amélioré la mort cellulaire induite par IR dans nos lignes de SLGC mais autophagie a été induite, nous avons supposé que les combinaisons triples avec l'autophagie inhibiteur CQ cliniquement applicable pourrait être efficace. CQ, comme une base faible, soulève la lysosomale pH et ainsi, comme bafilomycine A1, inhibe les étapes tardives de l'autophagie (la fusion de autophagosomes avec lysosomes et la dégradation subséquente de la cargaison). L'inhibition de la fin autophagy est un élément déclencheur de mort cellulaire par apoptose, en particulier dans les cellules exposées à des agents induisant autophagie 9. 31. 32. Pour déterminer les concentrations subtoxiques de CQ pour les expériences de combinaison triple, nous avons utilisé la première CQ en monothérapie ou 10 Gy IR. Seul, CQ a réduit la prolifération des SLGCs dose-dépendante (Fig. S5A) et induit la mort cellulaire (par apoptose) à des concentrations élevées (barres ouvertes dans la Fig. 4A). L'apoptose a été induite à 3050 M CQ, sauf dans GBM4 SLGCs où 100 M CQ était nécessaire. GBM8, la ligne la plus sensible à la radio - ou induite CQ-apoptose, est le seul des quatre lignes SLGC qui exprime l'proapoptotique protéine Bcl-2 Noxa (voir ci-dessous), et cette expression a été induite par CQ (Fig. S5B) . Développer Figure 4. CQ et IR induisent en synergie forte apoptose dans SLGCs. (A) Panneau supérieur: pourcentage de l'annexine V / PI cellules positives 5 d après le traitement par CQ seul (barres blanches) ou CQ, plus IR (barres grises). Les cellules ont été prétraitées avec CQ pendant 1 h, puis irradiées avec 10 Gy. En bas à gauche: exemple de l'analyse de cytométrie de flux de cellules apoptotiques et morts en bas à droite: la morphologie apoptotique observée après Hoechst 33342 / annexine V coloration à 3 jours après le traitement combiné. (B) de survie réduite des cellules clonogéniques 13 d après un traitement combiné. (C) la réduction de la taille des neurosphères préformées 7 jours après le traitement combiné. Viabilité de neurosphères a été déterminée après calcéine-AM coloration. (D, E), des Western blots représentatifs montrant l'effet de la CQ, ou CQ, plus IR sur les niveaux de la caspase-3 activé et de la conversion LC3-I / II (D) l'expression, ainsi que sur la phosphorylation de H2AX (H2AX) (E). (F) Le manque d'induction de la mort cellulaire dans les fibroblastes humains. Dans A et F, les données représentent les moyennes de trois expériences indépendantes. Des expériences en B et C ont été effectuées deux fois en triple exemplaire. La signification statistique est indiquée par un astérisque (p0.05). Test de la double combinaison de CQ et IR, nous avons constaté que CQ seul était déjà suffisant pour sensibiliser fortement les quatre lignes de SLGC à radioinduced apoptose (barres grises sur la Fig. 4A). Pour G166 et GBM4 SLGCs, cette apoptose fortement améliorée a été observée à des concentrations assez élevées CQ (30 ou 50 M, respectivement). En revanche, les effets pro-apoptotiques hautement synergiques ont déjà été détectés à des doses de 10 ou 20 M CQ dans GBM22 et GBM8 SLGCs. Radiosensibilisation par CQ a également été détecté dans des dosages clonogéniques, ainsi qu'après le traitement des sphéroïdes SLGC préformées de taille définie (Fig. 4B et C). L'apoptose induite par CQ seul ou en combinaison avec IR n'a pas été accompagnée par des modifications du cycle cellulaire (Fig. S5C) et semble être largement indépendante des caspases (Fig. 4D). Les niveaux de dommages à l'ADN radioinduced étaient inchangés ou réduits en présence de CQ (Fig. 4E), en dépit de son effet hautement synergique avec IR. L'effet pro-apoptotique hautement synergique a été accompagné par accumulation massive du marqueur autophagique LC3-II (Fig. 4D). Comme prévu, dose-dépendante seul CQ causé l'accumulation de LC3-II. Cependant, le taux de conversion LC3-I / II était invariablement plus élevé dans les cultures traitées avec l'IR, plus CQ (Fig. 4D et voir ci-dessous). Comme la différence des niveaux LC3-II en l'absence par rapport à la présence d'un inhibiteur de autophagy retard reflète le nombre de vésicules autophagiques qui sont transportés vers les lysosomes 29. 33. Cette expérience confirme que autophagy est induite dans les SLGCs en réponse à infrarouge. De plus, il indique que le blocage de la fin des étapes consistant autophagy combinée à une meilleure induction autophagy provoque une accumulation massive de autophagosomes, un déclencheur connu de l'apoptose 31. 32. 34. On notera que, après de longues périodes de traitement unique avec IR (ou inhibiteur de la voie PI3K / Akt ) niveaux LC3-II ne sont pas plus améliorées (voir aussi fig. 5B et S2 et de comparer à un point de temps plus tôt après le traitement comme indiqué sur la Fig. 3B). Depuis LC3-II lui-même est un substrat de l'autophagie, cela est très probablement due à l'amélioration de la prestation de lysosomale de LC3-II lorsque le flux autophagique est entièrement activé 29. 33. CQ des doses allant jusqu'à 50 M n'a pas de sensibiliser les fibroblastes humains normaux à radioinduced la mort cellulaire ( Fig. 4F), ce qui indique une certaine spécificité tumorale. Développer Figure 5. combinaisons triples de IR, un inhibiteur de PI3K / Akt et de faibles doses de CQ montrent additif aux effets pro-apoptotiques hautement synergiques dans SLGCs primaires. (A) Pourcentage de l'annexine V / PI cellules positives 5 d après le traitement avec 10 Gy, un inhibiteur de la voie PI3K / Akt (25 M inhibiteur de Akt III, 50 M LY294002, et 0,6 M PI-103) et CQ (aux doses indiquées ), seuls ou en combinaisons doubles ou triples. Panneau inférieur: exemple d'analyse de cytométrie de flux de GBM22 SLGCs montrant que la plupart des cellules traitées avec les combinaisons triples meurent par apoptose. (B) Western blot analyses montrant une forte accumulation de LC3-II dans des échantillons SLGC avec des proportions élevées de annexine V / PI cellules positives. En outre, les niveaux de pro - et anti-apoptotiques des molécules et de la caspase-3 clivée expression sont présentés. Les données contenues dans (A) sont des moyens de trois expériences indépendantes. La signification statistique est indiquée par un astérisque (p0.05). Nous avons ensuite testé triples combinaisons d'inhibiteurs de la voie PI3K / Akt avec 10 Gy IR et CQ à CQ des doses inférieures à celles agissant en synergie dans les doubles combinaisons avec IR. De telles combinaisons triples sont en effet très efficace dans toutes les lignes de SLGC (Fig. 5A et la Fig. S6). La potentialisation le plus fort de la mort cellulaire a été observée dans radioinduced SLGCs de GBM22. Dans cette ligne, des effets hautement synergiques ont été obtenus en combinant une irradiation 10 Gy avec une faible dose de CQ (10 M) et les doses subtoxiques des inhibiteurs de la voie PI3K trois différents / Akt. Dans GBM4 et G166 SLGCs, seul inhibiteur Akt III a causé des effets pro-apoptotiques synergiques, et GBM8 SLGCs, dans laquelle IR seul a causé une certaine apoptose, les effets ont été sous-additif synergique. La forte apoptose induite par les combinaisons triples a été accompagnée par une forte accumulation du marqueur autophagique LC3-II. Dans GBM22 SLGCs, l'apoptose est également accompagnée d'une régulation négative de la protéine anti-apoptotique Mcl-1 (Fig. 5B). Effets du traitement de combinaison triple à de faibles doses d'IR, CQ, et PI-103 Enfin, nous montrons que triples combinaisons de IR, la double classe I inhibiteur de PI3K / mTOR PI-103 et CQ a également entraîné des effets pro-apoptotiques synergiques lorsque GBM22 SLGCs, qui sont complètement cellulaires résistantes à 10 Gy d'irradiation à dose unique la mort, ont été traités avec des doses relativement faibles de tous les trois composantes (3,5 Gy IR, 0,5 M PI-103, et 5 M CQ), un résultat également intéressant pour une application clinique potentielle car des doses plus faibles provoquent moins d'effets secondaires. Bien que la double combinaison de PI-103 et IR a été fortement cytostatique (Fig. 6A et B panneaux de droite), une augmentation significative du nombre de cellules apoptotiques ou morts ne se trouvaient que dans les cultures traitées avec la combinaison triple y compris CQ. Cela est vrai pour tous les points de temps testés jusqu'à d13 après le traitement (Fig. 6A et B). Ici aussi, la mort cellulaire / apoptose est associée à la conversion la plus forte de LC3-I en LC3-II (fig. 6C). Cette conversion plus forte LC3-I / II dans les échantillons traités avec la combinaison triple par rapport aux combinaisons doubles avec CQ indique que doubles combinaisons de IR et d'un inhibiteur de la voie PI3K / Akt activent plus fortement autophagie que IR ou / inhibiteur de la voie Akt PI3K seul, et que plus vésicules autophagiques accumulent lors d'un traitement avec la combinaison triple par rapport aux doubles combinaisons avec CQ 29. 33. Ces résultats sont similaires à ceux obtenus avec bafilomycine A1 (voir Fig. S2). Développer Figure 6. De faibles doses d'IR, CQ et PI-103 induisent l'apoptose dans synergétique GBM22 SLGCs. (A, B) Gauche: Pourcentage de l'annexine V / cellules positives PI 5 ou 13 jours après le traitement avec soit IR (3,5 Gy), CQ (5 M) ou PI-103 (0,5 M) seul, avec des combinaisons doubles ou triples. le nombre de cellules après coloration au bleu trypan: Droite. Panneau inférieur en A: cytométrie de flux des données montrant que la mort cellulaire est produite principalement par l'apoptose. (C) Analyse par transfert Western de LC3-I / II et de conversion des niveaux d'expression de p21. Nous avons non seulement observé des effets synergiques dans l'apoptose / tests globaux de la mort cellulaire, des effets importants ont également été détectés dans la sphère formant des essais menés dans un essai de substitution de cellules souches pour évaluer l'effet sur les cellules clonogéniques. Ici aussi, la triple combinaison la plus efficace empêche la formation sphère (fig. 7A). Toutefois, dans cet essai la double combinaison de PI-103 et une irradiation de 3,5 Gy avéré être très efficace, peut-être en raison du fort effet cytostatique sur SLGCs (voir Fig. 6A et B). La triple combinaison était également plus efficace lorsqu'on utilise des sphères de trois dimensions de taille définie, ont été traitées. Il n'y avait pratiquement pas de cellules viables plusieurs jours après le traitement évaluée par coloration des cellules vivantes avec une viabilité colorant fluorescent (Fig. 7B). En revanche, pas de mort cellulaire significative n'a pu être détectée dans les fibroblastes humains normaux traités avec cette combinaison triple (Fig. S7), ce qui démontre que non seulement doubles combinaisons de IR et CQ (voir Fig. 4F), mais aussi ce traitement triple combinaison présente une certaine tumeur spécificité cellulaire. Développez Figure 7. Effets synergiques d'une combinaison triple à faible dose, y compris PI-103 dans les cellules souches des essais de substitution. (A) des cultures monocouches adhérentes de GBM22 SLGCs ont été traités pendant 5 jours comme décrit dans la Fig. 6. puis plaqué dans un milieu sans sérum pour former neurosphères. Sept jours plus tard neurosphères au total ont été comptés et photographiés. (B) Traitement des neurosphères 3D préformées. Les cellules ont été étalées pour former un Neurosphère par puits et 2 d ultérieurement traités comme indiqué. 7 jours après le traitement, les neurosphères ont été colorées avec la calcéine-AM pour déterminer la viabilité et le diamètre des sphères. Les données contenues dans (A et B) sont des moyennes de trois expériences indépendantes. La signification statistique est indiquée par un astérisque (p0.05). Discussion Il est généralement admis que les CSC contribuent fondamentalement à la résistance des tumeurs malignes à la chimiothérapie et la radiothérapie et que la voie Akt est particulièrement important pour la survie du SCC. Cependant, comment les inhibiteurs pharmacologiques de la voie PI3K / Akt affectent la survie post-irradiation et la mort cellulaire des cellules souches cancéreuses humaines primaire n'a pas été rapporté jusqu'à présent. Les glioblastomes sont résistantes aux thérapies conventionnelles. De nouvelles options thérapeutiques sont donc nécessaires de toute urgence. Pour identifier les SLGC agents de la mort de promotion, nous avons sélectionné un inhibiteur de l'Akt et deux inhibiteurs de la PI3K / mTOR pour étudier leurs effets sur la radioresponse des SLGCs primaires. Les deux PI3K / inhibiteurs de mTOR a montré des réponses cytostatiques très fortes, mais, étonnamment, n'a pas facilement promouvoir la mort cellulaire des SLGCs et fait même tendance à le réduire. Akt inhibitior III seulement légèrement favorisé la mort cellulaire induite par IR dans l'une des lignes SLGC examinés. La réponse à ces doubles combinaisons a été associée à l'autophagie et nous montrons ici pour la première fois que l'autophagie fin inhibiteur CQ seul ou en combinaison avec des inhibiteurs de la voie PI3K sélectionnée / Akt favorise fortement la mort cellulaire IR induite par des cellules souches cancéreuses humaines primaires. Notre étude devrait être de haute pertinence clinique non seulement parce qu'un inhibiteur de l'autophagie tardive cliniquement applicable a été utilisé, mais aussi parce que toutes les données présentées ont été obtenues à partir de cellules tumorales de patients dérivées de tumeurs souches ressemblant, une population considéré comme essentiel pour la progression tumorale et la résistance au traitement qui doit être éradiquée afin de parvenir à la survie sans récidive à long terme. (P53-dépendant) primaire apoptose est pas une réaction préférentielle de cellules tumorales solides à des traitements génotoxiques. Cependant, dans la plupart des lignes SLGC avec p53 non fonctionnel, nous détectons généralement une apoptose plus tard 4 jours après IR avec des doses unitaires modérées ou élevées (par exemple 5 ou 10 Gy) 21 tel qu'il est utilisé dans le traitement clinique hypofractionnée posologies 35. Comme ces lignes SLGC montrent prononcées G2M arrestation associé à la catastrophe mitotique, ceci est sans doute l'apoptose secondaire suite à une catastrophe mitotique létale. En revanche, SLGCs avec p53 fonctionnelle arrêtent seulement dans G1 et ne montrent pas la mort cellulaire pendant plus de 2 semaines après l'irradiation. Au cours de cette période, nous ne voyons pas la mort cellulaire dans la ligne de SLGC p53-deficient G166, qui, en dépit de G2M arrestation, ne présentent pas les caractéristiques de la catastrophe mitotique après IR 21. Ainsi, bien qu'il existe des différences dans la radioresponse des CSC, il est un grand besoin de radiosensibilisateurs du SCC, en particulier pour les tumeurs malignes très chimio - et radio résistant. En triples combinaisons avec IR et un inhibiteur de PI3K / Akt, CQ fortement promu SLGC l'apoptose à des concentrations entre 530 M et une double combinaison avec IR dans la gamme de 1050 M. Notre constatant que CQ favorise fortement la mort cellulaire dans SLGCs - irradiated peut contribuer à expliquer les résultats d'une étude clinique en Sotelo et al. qui ont rapporté que la CQ, ajouté à un protocole thérapeutique classique (chirurgie, plus radiochimiothérapie) pour glioblastome, de doubler la survie globale médiane par rapport aux groupes témoins 36. radiosensibilisation par CQ a déjà été signalé pour les lignées cellulaires tumorales classiques, le plus souvent en association avec l'hyperthermie 37. 38. mais radiosensibilisation des cellules de gliome ou CSCs hautement radiorésistantes, et ces puissants effets pro-apoptotiques synergiques de IR et CQ tel que rapporté ici uniformément pour un panel de SLGCs primaires ont pas été décrits auparavant. Peut concentrations de 550 M CQ être atteints sur le plan thérapeutique CQ est un médicament antipaludique pas cher, également utilisé pour traiter l'arthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux et d'autres maladies du tissu conjonctif 39. Les concentrations de plasma sanguin de crête d'environ 15 M rapportés dans la littérature pour CQ 40 sont égale ou légèrement en dessous des concentrations trouvées ici pour radiosensibiliser SLGCs. Cependant, CQ traverse la barrière hémato-encéphalique. Il accumule aussi dans certains tissus et organes à des niveaux très élevés, et les valeurs 1030 fois plus élevées que les concentrations plasmatiques de sang ont été décrits pour le cerveau 41. Par conséquent, les concentrations CQ requises pour radiosensibilisation de CSCs peuvent en effet être atteintes par l'administration systémique au moins pour certains entités tumorales, y compris des tumeurs cérébrales. application locale contrôlée de CQ peut être une stratégie de prestation de remplacement dans les tumeurs du cerveau. Est-ce un certain arrière-plan moléculaire associé à radiosensibilisation CQ-médiée SLGCs amélioration de la mort cellulaire forte a été observée pour les quatre lignes SLGC, y compris G166 et GBM22 qui, pour au moins deux semaines après l'irradiation, ne montrent pas de signes de la mort cellulaire même après des doses uniques élevées de IR tels que 10 Gy 21. Cependant, l'apoptose à la dose de CQ inférieure (10 ou 20 M) n'a été observée dans irradiée GBM22 et GBM8 SLGCs. La ligne GBM22 est la seule ligne exprimant p53 fonctionnelle et GBM8 la seule ligne exprimant la protéine Bcl-2 membre de la famille pro-apoptotique Noxa. Une influence positive de p53 fonctionnelle et une influence de Bcl-2 membres de la famille tels que Bax, Bak, et Bcl-xL ont déjà été remarqué que lorsque des lignées cellulaires tumorales classiques ont été exposés à CQ comme un seul agent 42 45. Noxa a été trouvé ici pour être induite par CQ. Noxa a récemment été montré pour promouvoir la mort cellulaire autophagique lors de l'expression de la protéine oncogène Ras 46. Les expériences futures sont nécessaires pour savoir si Noxa et p53 contribuent également à la mort cellulaire amélioration CQ-médiation dans CSCs - irradiated. Mécanistique, la forte synergie des pro-apoptotique IR / CQ-co-traitement des résultats probables de la combinaison de l'induction de autophagy (par le traitement génotoxique), avec une forte inhibition de la fin des étapes de autophagy (par CQ) 9. 31. 32. Sur le plan clinique, la radiothérapie peut avoir un avantage sur la chimiothérapie, car il est un traitement génotoxique local. Induction de dommages à l'ADN par CQ décrit par d'autres 47 pourrait également expliquer amélioré l'apoptose induite par IR. Cependant, nous avons observé aucun changement ou réduit les dommages de l'ADN radioinduced évaluée par H2AX. Réduction des dommages à l'ADN est compatible avec l'idée que CQ a des propriétés antimutagenes 48. qui peuvent également contribuer à ses effets antitumoraux. A deux exceptions près (inhibiteurs de Akt III GBM8 et LY294002 dans GBM22 SLGCs), nous avons trouvé que ce soit sans augmentation ni même une réduction de la mort SLGC radiogène en présence d'inhibiteurs de la voie PI3K / Akt. la mort cellulaire réduite a été observée pour SLGCs déficientes en p53 cotreated avec la voie PI3K / mTOR, des inhibiteurs de LY294002 ou PI-103. Comme nous l'avons déjà montré que p53-déficit, la prolifération et la catastrophe mitotique associée à G2M arrestation en corrélation avec l'IR-induite SLGC apoptose 21. fortement diminué la prolifération et a diminué l'arrestation de G2M susceptibles de contribuer aux effets de l'apoptose inhibitrice de LY294002 et PI-103 dans - irradiated SLGCs en plus de l'induction de l'autophagie. Manque de l'apoptose et des effets largement cytostatiques ont également été observées sur la monothérapie avec double PI3K inhibiteurs / mTOR dans les lignes de gliome classiques 4. 23. 27. À première vue, cela semble surprenant étant donné la forte inhibition comparable du régulateur de l'apoptose importante Akt par ces inhibiteurs une forte inhibition de l'Akt par PI-103 (un inhibiteur de PI3K / pan mTOR) peut être due à l'inhibition de mTORC2, la principale kinase cellulaire phosphoryler la sérine 473 de Akt 4. la forte réponse cytostatique G1 conjointement avec autophagy semble faciliter la survie des cellules dans le présence de tels inhibiteurs.